style="width:3.09994in" />GB/T 19180—2020 本文是学习GB-T 19180-2020 牛海绵状脑病诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了BSE 诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求。
本标准适用于BSE 的诊断，其中临床诊断适用于BSE 的监测和流行病学调查，H ·E
组织病理染 色法适用于 BSE
中枢神经系统的病理诊断，免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于 BSE
的病原学
诊断。
下列缩略语适用于本文件。
BSE: 牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy)
H ·E: 苏木精伊红(Hematoxylin and eosin)
HRP: 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)
PBS: 磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution)
PK 酶：蛋白酶 K(Proteinase K)
PVDF: 聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride)
SDS: 十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)
TBST: 等渗缓冲盐溶液(Tris-HCl buffered solution with Tween)
牛科和猫科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物。
表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿经过有缝隙的地面或进入畜
栏等。
表现为视、听、触三觉过于敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感，这是
BSE
病牛的特征性临床表现。
病牛步态呈"鹅步"状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。
病牛的体重和体况下降，表现出异常消瘦，体质虚弱。
GB/T 19180—2020
剖检无明显病变。
易感动物出现上述临床症状，又不能确定为其他疾病时，可判定为疑似 BSE。
确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断。
实验操作应在生物安全Ⅱ级以上的实验室进行。涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行，
如甲醛、甲酸、二甲苯、氯仿等。
显微镜、切片机、电锯/钢锯、骨钳、眼科剪、直形镊(长约25 cm)、
手术刀、切片刀、烘烤箱、脱水筐、
染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片、玻璃棒、染色架、量筒(量程分别为100
mL、1000 mL、5000 mL)、
通风橱。
4.1.3.1 蒸馏水。
4.1.3.2 10%中性福尔马林固定液(见附录 A 中 A.1
4.1.3.3 无水乙醇。
4.1.3.4 二甲苯。
4.1.3.5 氯仿。
4.1.3.6 软蜡(熔点56 ℃
4.1.3.7 硬蜡(熔点60℃
4.1.3.8 苏木素染液(H ·E 染液，见A.2
4.1.3.9 1%盐酸酒精(见 A.3
4.1.3.10 饱和碳酸锂水溶液(见 A.4
4.1.3.11 95%酒精伊红溶液(见 A.5
4.1.3.12 中性树胶。
4.1.3.13 无机试剂原料均为分析纯。
将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。剪开脑膜并切断
所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑，包括大脑、小脑和完整脑干。大规模监测采样时，可用专用采
样勺(国家牛海绵状脑病参考实验室提供)从枕骨大孔处取出延脑部组织即可。采样勺取样时，先上下
左右四个方向剪开脑硬膜，再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管，然后紧贴
颅腔壁插入采样勺，插入深度约5 cm～7cm。
用力将采样勺的手柄往上翘，再往下切断脑组织，然后左
右切断脑组织，最后将切下的脑组织往外抠出。
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将所有组织直接放入10倍体积的10%中性福尔马林固定液中渗透固定96
h,换新配制的固定液
再固定48 h。
4.1.6.1 取材
把大脑、小脑、脑干组织分离开，分别横切成3 mm～5 mm
厚的组织块，选取以下部位组织做进一
步处理，包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、四叠体、脑闩、延髓。适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用
脱水筐大小，剩余组织继续固定以备用。用脱水筐装好检测用的组织块，并用铅笔做好标记，盖好脱水
筐盖。投入新配制的10倍体积的固定液再固定72 h。
4.1.6.2 甲酸处理
将装有组织块的脱水筐移入98%甲酸中作用1 h,自来水冲洗20 min,
然后再移入新配制固定液中
处理3 h。
4.1.6.3 脱甲醛
将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，用缓慢流动的自来水漂洗24 h。
4.1.6.4 脱水
将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，依次在以下梯度酒精中分别脱水：
a) 75% 酒精浸泡2 h。
b) 85% 酒精浸泡2 h。
c) 95% 酒精 I 浸 泡 2h。
d) 95% 酒精Ⅱ浸泡2 h。
e) 100% 酒精 I 浸 泡 2 h。
f) 100% 酒精Ⅱ浸泡2 h。
4.1.6.5 透明
4.1.6.5.1 氯仿I 浸泡2.5 h 或者二甲苯 I 浸泡40 min。
4.1.6.5.2 氯仿Ⅱ浸泡3 h 或者二甲苯Ⅱ浸泡30 min。
4.1.6.6 浸蜡
依次在以下石蜡中浸蜡，温度为60℃:
a) 软蜡 I 浸泡40 min。
b) 软蜡Ⅱ浸泡1 h。
c) 硬蜡浸泡1 h。
4.1.6.7 包埋
4.1.6.7.1
若包埋模具为金属条结构的，则先组装好包埋模具，放置在光滑平整的金属台面上，再将熔
化的新硬蜡倒入包埋模具里，直至倒满，然后将浸好蜡的组织块放入其中(待切片的一面朝下，并放平
整)。如果一个模具里可以放置多个组织，则两个组织之间距离应大于1.5 cm。
冷却过夜，用切片刀修
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切成形，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。
4.1.6.7.2
如果包埋模具为凹型的用于单个组织包埋的模具(常见包埋机所用模具),则先将模具加热
至70℃,放置在同样温度的金属台面上，然后滴满熔化的新硬蜡，再将浸好蜡的组织块放入其中(待切
片的一面朝下，并放平整),用去除盖子的脱水筐(尺寸与包埋模具匹配)放于其上，最后将整个包埋模具
(包括组织等)平移至冷台上。待冷却好后，将脱水筐从包埋模具中取出，获得平整的石蜡组织块，然后
给每个组织块贴上标签。
4.1.6.8 切片
将石蜡组织块切成5μm
厚的组织薄片。每块组织连续切片3片～10片，切片刀、碎屑和废弃组织
应焚烧处理。组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片(组织应贴在磨砂面/标记面的同侧，以
便给玻片做标记),然后用铅笔在载玻片上做好标记。
4.1.6.9 烤片
贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干，然后放入烘烤箱中50℃烘烤4 h
以上。
4.1.7.1 脱蜡和脱二甲苯
取烘烤好的玻片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：
a) 二甲苯 I 10 min。
b) 二甲苯Ⅱ10 min。
c) 100% 酒 精I2 min。
d) 100% 酒精Ⅱ2 min。
e) 95% 酒精 I2 min。
f) 95% 酒精Ⅱ2 min。
g) 85% 酒精2 min。
h) 75% 酒精2 min。
i) 自来水洗2 min。
4.1.7.2 H ·E 染色
4.1.7.2.1 苏木素染液15 min。
4.1.7.2.2 自来水漂洗2 min。
4.1.7.2.3 1%盐酸酒精10 s。
4.1.7.2.4 自来水漂洗5 min。
4.1.7.2.5 饱和碳酸锂水溶液30 s。
4.1.7.2.6 自来水漂洗10 min。
4.1.7.2.7 75%酒精2 min。
4.1.7.2.8 85%酒精2 min。
4.1.7.2.9 95%酒精伊红液1 min。
4.1.7.3 脱水和透明
4.1.7.3.1 95%酒精2 min。
4.1.7.3.2 100%酒精 I2 min。
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4.1.7.3.3 100%酒精Ⅱ2 min。
4.1.7.3.4 二甲苯I2 min。
4.1.7.3.5 二甲苯Ⅱ2 min。
4.1.7.4 封片
用干净玻璃棒取一滴中性树胶，滴加在玻片的组织上，再用干净的盖玻片进行封片，放置在平整的
台面上使其自然干燥。
4.1.7.5 镜检及判定
4.1.7.5.1 分别在倍数为10×10、10×20和10×40的光学显微镜下观察切片。
4.1.7.5.2
阳性结果。灰质区出现空泡变性，特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆
形空泡，空泡内不着色或被伊红淡染，界限明显，胞核被挤压于一侧，甚至消失；有的神经细胞被单个或
多个特异性空泡胀大，成为"气球样"空泡性神经细胞。容易出现空泡病变的部位是中脑和延髓的核群，
且呈双侧对称性分布。
4.1.7.5.3 阴性结果。灰质区无特征性空泡变性。
4.1.7.5.4
在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应
注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断。
组织病理学诊断只是疯牛病确诊的辅助方法，确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法。
见4.1.1。
见4.1.2。另外，还需要高压锅(温度能达到134
℃)、水浴锅、恒温箱、冰箱(含冷冻和冷藏)、电磁
炉、金属锅(烧水用)、陶瓷锅(直径不少于18 cm)、
湿盒(在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒)、
微量移液器(量程分别为0.5μL～10μL、5μL～50μL、10μL～100μL、50μL～200μL、100μL～1000μL)。
4.2.3.1 蒸馏水。
4.2.3.2 10%中性福尔马林固定液(见 A.1
4.2.3.3 无水乙醇。
4.2.3.4 二甲苯。
4.2.3.5 氯仿。
4.2.3.6 软蜡(熔点56 ℃
4.2.3.7 硬蜡(熔点60 ℃
4.2.3.8 蛋白酶 K 缓冲液(见附录 B 中 B.1
4.2.3.9 蛋白酶 K 工作液(见B.2
4.2.3.10 高压缓冲液(见 B.3
4.2.3.11 3%双氧水- 甲醇(见
B.4,如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中 的试剂)。
4.2.3.12 0.1 mol/L PBS( 见 B.5
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4.2.3.13 5%正常猪血清(见
B.6,如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中
的试剂，但不得使用反刍动物源性血清)。
4.2.3.14 Mayer 氏苏木素液(商品化产品
4.2.3.15 水溶性封片剂(商品化产品
4.2.3.16
二步法免疫组织化学显色试剂盒(商品化产品，其中二抗应为抗鼠二抗)。
4.2.3.17 一抗(商品化产品
4.2.3.18 无机试剂原料均为分析纯。
见4.1.4。
见4.1.5。
见4.1.6。
4.2.7.1
设置对照。免疫组织化学诊断应设置疯牛病阳性和阴性对照组织切片。
4.2.7.2
脱蜡和脱二甲苯。取烘烤好的玻片和对照切片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和
脱二甲苯：
a) 二甲苯 I 10 min。
b) 二甲苯Ⅱ10 min。
c) 100% 酒精 I2 min。
d) 100% 酒精Ⅱ2 min。
e) 95% 酒精 I2 min。
f) 95% 酒精Ⅱ2 min。
g) 85% 酒精2 min。
h) 75% 酒 精 2 min。
i) 自来水洗2 min。
4.2.7.3 从自来水中取出装有玻片的染色架，在 PBS 中
洗 5 min×3 次。在洗第一次 PBS 的同时，配制 适量的蛋白酶 K
缓冲液，并放入水浴锅中预热37℃。另外，取出冷冻的蛋白酶 K 母液使其化冻，以
待用。
4.2.7.4 在最后一次 PBS 漂洗时，配制好蛋白酶 K
工作液。 PBS 洗完后，立即将玻片放入装有蛋白酶 K
工作液的染色缸中，并确保玻片全部浸入液体，在37℃水浴中消化处理15 min。
与此同时，准备好 煮沸的蒸馏水，并配制好高压缓冲液。
4.2.7.5
将高压缓冲液倒入陶瓷锅，并立即将玻片放入其中，确保玻片完全浸入水中，盖好盒盖，在
121℃(约103 kPa) 高压处理20 min,自然冷却至60℃以下取出。
4.2.7.6 在 PBS 中 洗 5 min×3
次，洗最后一遍时配制好3%双氧水甲醇溶液。
4.2.7.7 将玻片完全浸入3%双氧水甲醇溶液中室温处理5
min。
4.2.7.8 在 PBS 中洗5 min×3
次。如果正常猪血清是冷冻的，则需要提前取出化冻，用前5 min 配 制好。
4.2.7.9
在玻片的组织上滴满5%正常猪血清，置湿盒中轻轻盖上盖子，室温作用20 min 。
同时，取出
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冷冻的一抗进行化冻，并配制好工作液。
4.2.7.10
弃去正常猪血清，用吸水纸吸干组织四周的液体。
4.2.7.11
将一抗工作液滴加在组织上，确保组织完全覆盖，湿盒中37℃作用4 h,
或者在2℃~8℃下 作用过夜。
4.2.7.12 在 PBS 中 洗 5 min×3
次，同时取出2℃~8℃下保存的免疫组织化学显色试剂盒，使其回温
至室温状态。
4.2.7.13
洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满显色试剂盒中的标记聚合物-HRP
的抗鼠二抗，湿盒中室温作用30 min。
4.2.7.14 在 PBS 中洗5 min×3 次 。
4.2.7.15
洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液，确保组织
完全覆盖，湿盒中室温作用5 min～10 min。
4.2.7.16 在蒸馏水中漂洗3 min×3 次。
4.2.7.17 将玻片放入 Mayer 氏苏木素液复染作用1
min。
4.2.7.18 在蒸馏水中漂洗5 min。
4.2.7.19 用水溶性封片剂封片。
4.2.8.1
在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下，分别在倍数为10×10、10×20和10×40的光学
显微镜下观察组织玻片，进行结果判定。
4.2.8.2
阳性结果：脑组织灰质区特别是脑闩部的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现特
异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阳性。
4.2.8.3
阴性结果：脑组织灰质区未见特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阴性。
见4.1.1,但组织匀浆、消化及变性时需在负压罩下操作。
电泳仪、半干转印仪、组织匀浆机、化学发光成像仪、冰箱(含冷冻和冷藏)、温箱(能恒定在37℃)、
金属浴、摇床、电子天平、平皿(直径为12 cm～15
cm)、玻璃棒、眼科剪、眼科镊、保鲜膜、玻璃板(大小约 20 cm×20
cm)、专用铲刀(用于撬开预制胶)、塑料桶、微量移液器(量程分别为0.5μL～10μL、5μL~
50μL 、10μL～100μL 、50μL～200μL 、100μL～1000μL)。
4.3.3.1 蒸馏水。
4.3.3.2 10道泳道的12% SDS NuPage
胶(又称预制胶，商品化产品)。
4.3.3.3 预染蛋白质 Marker (商品化产品，应含有15
kDa～35 kDa 之间的蛋白条带)。
4.3.3.4 匀浆缓冲液(见附录 C 中 C.1
4.3.3.5 蛋白酶K 溶液(见C.2
4.3.3.6 消化阻止液(见C.3
4.3.3.7 上样缓冲液(见C.4
4.3.3.8 电泳缓冲液(商品化产品，与12% SDS NuPage
匹配)。
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4.3.3.9 甲醇。
4.3.3.10 TBST ( 见 C.5
4.3.3.11 转印缓冲液(见 C.6
4.3.3.12 封闭液(见C.7
4.3.3.13 PVDF 膜 。
4.3.3.14 3MM 滤纸。
4.3.3.15 一抗(商品化产品
4.3.3.16 标 记 HRP 的兔抗鼠 IgG
(商品化产品)工作液(见C.9)。
4.3.3.17 化学发光显色试剂盒(商品化产品
4.3.3.18 阳性对照(见C.10
4.3.3.19 阴性对照(见 C.11
4.3.3.20 无机试剂原料均为分析纯。
通过枕骨大孔采集脑闩部组织，并于- 15℃~ -20℃冷冻保存待用。
4.3.5.1 样品处理
取100 mg～130mg 脑闩部组织放入1.5 mL 的专用匀浆管中，加入1.2 mL
匀浆缓冲液。用匀浆
机以6200 r/min 的速度匀浆45 sec。 将匀浆好的样品吸取到1.5 mL
离心管中，以7000g 离心5 min,
然后将上清移至另一离心管中。
4.3.5.2 PK 酶消化
取 5 0 μL 离心好的样品、阳性对照、阴性对照分别移至1.5 mL
离心管中，各加入5μL 蛋白酶 K 溶 液，使蛋白酶 K 终浓度达到50μg/mL
以上，混匀后放在48℃金属浴中消化40 min。 为防止消化过程
中离心管盖被热气体撑开，可以加一重物如铁块压住盖子。消化完后各加入3 μL
消化阻止液阻止蛋白
水解反应。
4.3.5.3 蛋白变性
在消化完的样品、阳性对照、阴性对照中分别加入50μL
上样缓冲液，混匀后置96℃金属浴中变性
4.3.5.4 电泳
4.3.5.4.1
将预制胶安放好，在电泳槽内槽加满电泳缓冲液的工作液(不要溢出),外槽加至浸没过胶底
端1/3处和电泳槽中的导热丝(总共需要约400 mL
电泳缓冲液)。如果电泳仪与预制胶不匹配，则可 以自行配制12% SDS
Page胶，配方及操作可参见相关资料。
4.3.5.4.2 两端平行地拔出梳子，在第一道泳道加入10 μL 蛋 白 质Marker,
第二道泳道加入12 μL 阳 性 对照，第三道泳道加入12 μL
阴性对照，在其余泳道加入12 μL 变性完的样品(样品要趁热加)。安装好
电泳装置，接通电源，设定电压200 V、 时间40 min
进行电泳。同时，配制好转印缓冲液，放2℃~8℃ 预冷。
4.3.5.5 电转印
4.3.5.5.1
电泳完后，取出预制胶。用专用铲刀从四周撬开预制胶外壳，切掉胶的加样齿孔及胶底部染
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液线以下部分。在胶上倒一点转印缓冲液，使胶保持湿润。然后按照胶的大小，剪好
PVDF 膜 及 4 张 滤纸，PVDF 膜应比滤纸稍大。将 PVDF 膜放入100%甲醇中浸湿1
min, 之后将滤纸和膜放入转印缓
冲液中浸泡平衡15 min。
4.3.5.5.2
在玻璃板上先放置两层对齐的滤纸，用玻璃棒沿一个方向轻赶气泡，用铲刀将胶取出放于滤
纸上，并与滤纸对齐。夹取另两张滤纸，滴一些转印液在胶上，并使胶全部浸湿，然后将浸好的膜从一端
慢慢往另一端放下，直至完全覆盖在胶上。如果发现膜与胶之间有白点，说明它们之间存在气泡，则用
玻璃棒滚动将其驱赶。如果气泡太多，则取下膜，在转印液中再次浸湿，重新放置于胶上。如此反复，直
至没有气泡。然后，将取出另两层滤纸整齐放于膜上，用玻璃棒驱赶气泡。"三明治"做好后，用铲刀将
其转入转印槽中，注意膜的一端朝向正极。往"三明治"上倒入少量转印缓冲液，再用玻璃棒轻赶气泡。
4.3.5.5.3 盖上盖子，接通电源，设定电压15 V、时间15 min 进行转印。
4.3.5.6 封闭
转印结束后，弃去胶和滤纸。观察 Marker 转印效率，如果膜上有清晰的 Marker
条带，说明转印效
率良好，否则转印失败。将膜放入装有封闭液的平皿中，确保膜完全(至少有蛋白的区域)浸没，4℃作
用过夜或者37℃作用1 h。
注意与胶接触的一面朝上，以后的步骤都是这样。封闭结束，置摇床上用
TBST 摇洗3次，每次5 min。
4.3.5.7 一抗作用
将膜放入一抗工作液中，确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育1.5 h。
作用完后，置摇床上用
TBST 摇洗6次，每次5 min。
4.3.5.8 二抗作用
将膜放入标记 HRP 的兔抗鼠IgG
工作液中，确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育1 h。 孵育
40 min后，打开化学发光成像仪进行预热。孵育完后，置摇床上用TBST
摇洗6次，每次5 min。
4.3.5.9 底物作用
按照化学发光显色试剂盒说明书配制好化学发光底物溶液(至少5 mL),
混合均匀。将膜放置在一
干净平皿中，将底物溶液滴加到膜的表面上，作用10 min。
4.3.5.10 化学发光
按照5倍于膜的大小剪一块保鲜膜，并将其展平放于桌上。底物作用完后，将膜取出。再将膜平放
在保鲜膜中间位置，拿起保鲜膜的一边，沿PVDF 膜的一边折起，覆盖在 PVDF
膜上，再将周边的保鲜 膜稍微折叠，即可放入化学发光成像仪中或通过X
光胶片曝光。 一般情况曝光2 min～3min 即可。若
条带太浅，则需要增加曝光时间；相反，则应减少曝光时间，直至效果最佳。注意，每次都要以图片格式
保存好照片，以便判定结果。
4.3.6.1
在阳性对照和阴性对照均成立的条件下，才可判定其余样品的结果。
4.3.6.2
阳性结果：曝光照片上的样品泳道出现三条特异性黑色条带，且对比胶上的蛋白质
Marker 分 析条带大小在17 ku～33 ku之间，则判定为疯牛病阳性。
4.3.6.3
阴性结果：曝光照片上的样品泳道没有特异性黑色条带，或者有个别杂条带，但对比胶上的蛋
白 质Marker 分析条带大小不在17 ku～33ku 之间，则判定为疯牛病阴性。
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5.1
临床无明显特征性症状或判定为疑似的易感动物，经4.2(免疫组织化学方法)或者4.3(免疫印迹
方法)检测出牛海绵状脑病病原，则可判定为感染牛海绵状脑病。
5.2 免疫组织化学方法诊断 BSE 时应同时使用H ·E
组织病理染色法予以辅助确诊。
5.3 免疫印迹方法诊断 BSE 时，如果样品适合进行 H ·E
组织病理染色，那么也应同时使用H ·E 组 织病理染色法予以辅助确诊。
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(规范性附录)
H ·E 组织病理染色法试剂配制
A.1 10% 中性福尔马林固定液
A.1.1 配方
氯化钠
蒸馏水
甲醛
A.1.2 配法
把以上材料混匀溶解即可使用。
A.2 苏木素染色液
A.2.1 配方
苏木精
无水乙醇
蒸馏水
氧化汞
冰乙酸
钾明矾
A.2.2 配法
先将苏木精溶于无水乙醇，然后将钾明矾和蒸馏水煮沸溶化，去火并迅速加入苏木精无水乙醇溶液
中，立即加入氧化汞并煮沸，迅速冷却后加入冰乙酸，过滤后使用。
A.3 1% 盐酸酒精
在100 mL 的70%或80%酒精中加入1 mL 的浓盐酸。
A.4 饱和碳酸锂水溶液
碳酸锂2 g 加100 mL 蒸馏水，充分溶解。
A.5 95% 酒精伊红溶液
伊红0.5 g 加入100 mL95% 酒精中溶解。
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(规范性附录)
免疫组织化学方法试剂配制
B.1 蛋白酶 K 缓冲液
盐酸三羟甲基氨基甲烷(1 mol/L,pH 8.0)
氯化钙(0.1 mol/L)
加蒸馏水至
B.2 蛋白酶 K 工作液
使用前在蛋白酶K 缓冲液中加入17 μL 蛋白酶K
母液(蒸馏水配制，浓度为14.7mg/mL), 使其工
作浓度达5μg/mL。
B.3 高压缓冲液
0.1 mol/L柠檬酸钠 123 mL
0.1 mol/L柠檬酸 27 mL
煮沸的蒸馏水 1350 mL
配制时，先将蒸馏水煮沸，然后加入0.1 mol/L 柠檬酸钠和0.1 mol/L
柠檬酸混匀即可。
B.4 3% 双氧水一甲醇(使用前5 min 配制)
甲醇
双氧水(30%)
B.5 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)
氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
加水800 mL 溶解，用浓盐酸调pH 值到7.4,加水至1 L。
B.6 5% 正常猪血清
0.1 mol/L PBS(pH 7.4)
正常猪血清
8
0.2
1.44
0.24
B.7 一 抗 工 作 液
一抗为商品化的鼠抗牛朊蛋白单克隆抗体，用0.1 mol/L PBS(pH
7.4)稀释单抗，使其工作浓度达 到5μg/mL。
GB/T 19180—2020
(规范性附录)
免疫印迹方法试剂配制
C.1 匀浆缓冲液
盐酸三羟甲基氨基甲烷(pH 7.5) 100 ml
氯化钠 0.88 g
Triton X- 100 0.5 mL
脱氧胆酸钠 0.5 g
乙二胺四乙酸 0.29 g
充分溶解混匀即可使用，溶解不充分时可加热。可在4℃下保存数周。
C.2 蛋白酶 K 溶液
盐酸三羟甲基氨基甲烷(pH 8.0) 10 mL
氯化钙 11.1 mg
蛋白酶 K 6 mg
C.3 消化阻止液
174 mg苯甲基磺酰氟，溶于10 mL 异丙醇，使其浓度为100 mmol/L。
使用时的工作浓度约为
5 mmol/L。 配好后应分装保存在-20℃。
或者用市场上其他的 PK 酶阻止液，按照说明书配制使用即可。
C.4 5×上样缓冲液
1 mol/L盐酸三羟甲基氨基甲烷(pH 6.8) 0.6 mL 50%甘油 5 mL 10% SDS 2 mL
2-巯基乙醇 0.5 mL 1%溴酚蓝 1 mL 蒸馏水 0.9 mL
使用时取1份5×上样缓冲液，加蒸馏水4份，并充分混匀。可在4℃下保存数周。
C.5 TBST
氯化钠 8 g
氯化钾 0.2 g
三羟甲基氨基甲烷 3 g
GB/T 19180—2020
加蒸馏水至800 mL 溶解，加浓盐酸调 pH 值至7.4(大约需要1.9 mL
浓盐酸),后加蒸馏水定容至
1000mL, 最后加入500 μL Tween-20。
C.6 转印缓冲液
三羟甲基氨基甲烷 3.028 g
甘氨酸 14.413 g
加蒸馏水溶解至900 mL, 再加100 mL100% 甲醇，用前放置2℃~8℃预冷。
C.7 封闭液
牛血清白蛋白
TBST
充分溶解即可使用
C.8 一抗工作液
一抗为商品化的鼠抗牛朊蛋白单克隆抗体(也能与痒病病原结合),用含1%牛血清白蛋白的
TBST 溶液稀释单抗，使其工作浓度达到5μg/mL。
C.9 标记 HRP 的兔抗鼠 IgG 工作液
用含1%牛血清白蛋白的 TBST 溶液稀释抗体，使其工作浓度达到5μg/mL。
C.10 阳性对照
取免疫组化方法验证为痒病阳性的脑闩部组织100 mg,
按照4.3.5.1的要求进行匀浆、离心处理， 并以每管50 μL 分装于1.5 mL
离心管中， -20℃冷冻保存待用。制作过程中的生物安全要求见4.3.1
规定。
C.11 阴性对照
取免疫组化方法验证为痒病阴性的脑闩部组织100 mg,
按照4.3.5.1的要求进行匀浆、离心处理，
并以每管50 μL 分装于1.5 mL 离心管中， 一20℃冷冻保存待用。
style="width:3.09994in" />GB/T 19180—2020
更多内容 可以 GB-T 19180-2020 牛海绵状脑病诊断技术. 进一步学习